Набор инструментов генного инженера

Продукты высоких технологий - постоянная тема публикаций "Компьютерры", однако чаще всего речь в них идет о микросхемах, новейших устройствах хранения и обработки данных, визуализации и тому подобных вещах, которые постепенно становятся все более привычными, утрачивая неповторимый флёр новизны…

Рассказ о работе удивительных молекул, ставших инструментами генных инженеров, будет гораздо понятнее, если рассмотреть какую-нибудь занятную технологическую задачу. Например, поставить перед собой цель создать трансгенную светящуюся мышь. В хозяйстве она вряд ли пригодится, зато у ваших соседей наверняка такой не окажется.

Припомним теорию: вся информация об устройстве нашего организма записана в длиннющих молекулах ДНК, которые состоят из четырех типов нуклеотидов (назовем их A, T, G и C), последовательно соединенных друг с другом. Каждая клетка организма содержит полный набор ДНК - так называемый геном.

Каждый ген кодирует один белок. Белки тоже являются полимерными молекулами, но в отличие от ДНК они построены не из нуклеотидов, а из двадцати типов аминокислот. Три последовательно соединенных нуклеотида ДНК однозначно кодируют одну аминокислоту белка: например, триплет A-T-G кодирует одну и ту же аминокислоту как у человека, так и у какой-нибудь бактерии. Благодаря такой унифицированности мы можем переносить гены из одного живого существа в другое.

В принципе, любую последовательность нуклеотидов можно синтезировать химически. Однако мы пока не можем сами придумать ген, определяющий нужные нам свойства. Зато мы можем попытаться найти живое существо, обладающее такими свойствами (в нашем случае - способность к флуоресценции), и выделить нужный ген из него. Для этих целей выберем морские кораллы. Обычно их окраска флуоресцентная: если в темноте посветить на живой коралловый риф синей лампочкой (например, из детектора валюты), он засияет всеми цветами радуги. Это светятся так называемые GFP-подобные белки, содержащиеся в кораллах, - среди них есть голубые, зеленые, желтые и красные. Наша задача заключается в выделении из коралла и подготовке к внедрению в мышь гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок.

Включаем центрифугу…

Для начала необходимо раздобыть живой коралл, убедиться, что под ультрафиолетовой лампой он светится (то есть содержит нужный нам белок), и выделить из него РНК. Как правило, поиск нового гена начинается именно с РНК - она не содержит ненужных нам некодирующих белок участков. Однако в работе с РНК есть свои сложности: в частности, она быстро разрушается специальными ферментами, обильно выделяемыми нашим организмом для защиты от вирусов. Поэтому заранее поставим одноразовые пластиковые пробирки на лед (при низкой температуре ферменты работают хуже) и наденем резиновые перчатки. Кроме пробирок нам понадобятся настольная центрифуга, несколько автоматических пипеток с одноразовыми наконечниками и набор реактивов для выделения РНК.

Аккуратно отщипываем от коралла маленький (чуть больше спичечной головки) кусочек ткани и помещаем в пробирку. В нее же наливаем реагент для разрушения ткани и начинаем теребить кусочек коралла пипеткой. Все надо делать быстро, иначе РНК успеет развалиться. Когда большая часть ткани растворится, начинаем крутить пробирку в центрифуге. Осадок трогать не станем, отберем только жидкость и перенесем ее в другую пробирку.

Теперь мы имеем раствор, в котором содержатся белки, ДНК, РНК и масса других компонентов. Из всей этой смеси нам нужна только РНК. Для разделения (фракционирования) разных классов биологических молекул используется, как правило, изменение их растворимости - например, если добавить в наш раствор спирта и немного соли, большая часть ДНК и РНК выпадут в осадок. Еще раз "прокрутив" пробирку на центрифуге и удалив жидкость, мы получим обогащенный РНК образец. Эту процедуру придется повторять несколько раз, добавляя в смесь разные вещества; в итоге мы избавимся от большинства примесей и получим относительно чистый раствор молекул РНК, часть которых, как мы надеемся, кодирует нужный нам белок.

Для дальнейшей работы уже недостаточно физико-химических методов. Тонкие операции с биологическими молекулами мы будем проводить, используя инструментарий, позаимствованный у природы, а именно ферменты.

В молекулярной биологии применяется множество ферментов, выделенных из разных организмов, - если их поместить в подходящий по составу солевой раствор и добавить все необходимые для реакции компоненты, ферменты заработают в пробирке так же, как и внутри клетки. Выделять нужные ферменты нам не придется, все они продаются специализированными компаниями.

Ревертаза

Теперь на основе каждой молекулы РНК мы должны синтезировать соответствующую ей (комплиментарную) молекулу ДНК (кДНК). ДНК более стабильна, а главное, для работы с нею существует гораздо больше методов. Правда, большинство живых существ не умеет строить ДНК по РНК (наоборот, ДНК является матрицей, с которой обычно синтезируется РНК), однако из этого правила есть исключения. Так называемые ретровирусы (к ним относится, например, ВИЧ - вирус, вызывающий СПИД) почему-то выбрали именно РНК для хранения своей наследственной информации. Для размножения ретровирус должен встроить свои гены в геном жертвы, поэтому с вирусной РНК должна сперва считаться ДНК-копия. Такая реакция называется обратной транскрипцией. Ретровирусы "изобрели" для нее специальный фермент, ревертазу, чем сильно поспособствовали прогрессу молекулярной биологии.

Для работы ревертазе требуется так называемая затравка - короткий фрагмент ДНК, заранее прикрепленный к молекуле РНК. Когда ревертаза натыкается на затравку, она "садится" на РНК и ползет по ней в направлении от конца к началу молекулы. При этом ревертаза захватывает из раствора отдельные нуклеотиды и присоединяет их к затравке, тем самым удлиняя цепочку ДНК. РНК при этом играет роль матрицы.

Праймеры

Синтез кДНК мы проведем с помощью набора реактивов SMART, выпускаемого фирмой Clontech (США). Кроме ревертазы и солевого буфера, в котором этот фермент работает, в набор входят также два коротких (длиной около пятидесяти нуклеотидов) фрагмента одноцепочечной ДНК - праймеры. Каждая цепочка синтезированной нами кДНК будет начинаться с одного из этих праймеров и заканчиваться последовательностью нуклеотидов второго праймера. Для чего это нужно, мы скоро узнаем.

У животных все молекулы РНК, кодирующие белок (есть и другие, но сейчас нам это не важно), заканчиваются несколькими десятками идущих подряд нуклеотидов А (поли-А). Благодаря этому мы можем использовать в качестве затравки первый праймер, содержащий комплиментарную последовательность, поли-Т. Присоединяя нуклеотиды к праймеру поли-Т, ревертаза ползет по РНК, синтезируя ее ДНК-копию. Когда ревертаза доходит до самого начала молекулы РНК, происходит еще одно важное для нас событие. Разогнавшийся фермент не останавливается сразу, а достраивает еще три лишних нуклеотида С. Тут в игру вступает второй праймер, до сих пор свободно плававший в растворе. К его концу химически присоединен маленький кусочек РНК, состоящий всего из трех нуклеотидов, G-G-G. Этими нуклеотидами он "прилипает" к свешивающейся с только что синтезированной ДНК последовательности C-C-C, как бы продолжая собой цепочку РНК. Обманутая ревертаза обнаруживает, что матрица еще не кончилась, и достраивает на конце молекулы ДНК последовательность, комплиментарную "прилипшему" праймеру.

Таким образом, мы получили набор одноцепочечных молекул ДНК, комплиментарных РНК коралла, но дополнительно содержащих на концах известные нам нуклеотидные последовательности праймеров (адаптеры). Правда, искать среди этих молекул ген зеленого флуоресцентного белка пока рано, у нас для этого слишком мало материала. Чтобы наработать достаточное количество кДНК, мы воспользуемся одним из самых важных достижений молекулярной биологии - методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Полимераза

Так же, как в только что использованной нами реакции обратной транскрипции, основным компонентом ПЦР является фермент - выделенная из бактерий, живущих в горячих источниках, термостабильная ДНК-полимераза. Подобно ревертазе, ДНК-полимераза синтезирует молекулу ДНК, присоединяя отдельные нуклеотиды к затравке комплиментарно матрице, только в качестве матрицы на сей раз используется ДНК, а не РНК. ДНК-полимеразы есть у всех животных (собственно, они необходимы для удвоения ДНК при делении клеток), особенностью же термостабильной полимеразы является ее способность работать при высокой температуре.

…и амплификатор

Для проведения полимеразной цепной реакции добавим к одноцепочечной кДНК полимеразу, оптимизированный для ее работы солевой буфер, смесь нуклеотидов и два праймера, соответствующих добавленным на концы кДНК адаптерам. Теперь нам понадобится специальная лабораторная установка - амплификатор. Несмотря на свою дороговизну (а стоит такой прибор как автомобиль) амплификатор представляет собой всего лишь хороший программируемый термостат, способный быстро менять температуру. Ставим пробирку в амплификатор и запускаем программу: прибор должен сначала прогреть раствор до 95 °С, затем снизить температуру до 60 °С, затем подержать пару минут 72 °С и начать все с начала. В принципе, вместо амплификатора можно использовать три термоса с подогретой водой - раньше так и делали, только рука устает пробирку переносить. Давайте теперь посмотрим, что же будет происходить в нашей смеси.

При температуре 95 °С цепочки ДНК и РНК отходят друг от друга. РНК нас больше не интересует, скорее всего она развалится в ближайшее время. Когда температура опускается до 60 °С, один из праймеров прилипает к соответствующей ему нуклеотидной последовательности адаптера на конце молекулы ДНК. При последующем повышении температуры до 72 °С начинает работать термостабильная ДНК-полимераза - мы как раз достигли оптимальной для этого фермента температуры. Полимераза "садится" на прилипший праймер и, перемещаясь по молекуле, начинает присоединять к ней нуклеотиды.

За первый цикл полимеразной цепной реакции ДНК-полимераза построила комплиментарные цепи для каждой одноцепочечной молекулы кДНК, находящейся в реакционной смеси. Теперь мы получили полноценную двухцепочечную ДНК, но завершать реакцию пока рано - нам необходимо наработать больше материала. ПЦР продолжается: 95 °С - цепи ДНК расходятся; 60 °С - праймеры садятся на ДНК; 72 °С - полимераза достраивает праймеры, превращая их в новые цепи ДНК. За каждый цикл количество ДНК в пробирке удваивается; таким образом, за двадцать циклов ПЦР для каждой молекулы ДНК мы получаем 220 точных копий. Вся работа заняла около часа, ксероксам подобные скорости и не снились. Итак, мы имеем достаточно ДНК, а главное, всегда сможем дополнительно ее амплифицировать, проведя еще одну полимеразную цепную реакцию.

Векторные плазмиды

Теперь в нашей пробирке плавает не меньше миллиона копий гена зеленого флуоресцентного белка. Однако в том же растворе находятся еще миллиарды копий других молекул ДНК, и нам надо как-то "отделить зерна от плевел". Мы уже знаем, что физико-химические методы здесь не годятся: разные молекулы ДНК слишком похожи друг на друга. Для поиска гена зеленого флуоресцентного белка мы воспользуемся главным свойством именно этого белка - флуоресценцией.

Все имеющиеся в растворе гены коралла мы введем в бактерии так, чтобы каждая из них получила один ген. Бактерии в норме "не умеют" флуоресцировать - если мы найдем флуоресцентную бактерию, значит, внутри нее работает (экспрессируется) ген флуоресцентного белка из коралла. Молекулярные биологи часто используют в своих целях лабораторные штаммы кишечной палочки E. coli (эти бактерии относительно безопасны для человека, какое-то их количество всегда присутствует в нашем кишечнике).

Отличительной чертой бактерий является то, что часть генетической информации у них содержится в коротких кольцевых молекулах ДНК - плазмидах. Многие биотехнологические компании торгуют очищенными плазмидами (векторами), специально предназначенными для решения разных молекулярно-технологических задач. Нам необходимо купить или попросить у знакомых биологов вектор для экспрессии чужеродных генов в бактериях, вставить в него нашу кДНК и перенести полученную конструкцию в бактерию.

Рестриктаза

Чтобы все это сделать, мы должны сначала разрезать кольцевую молекулу ДНК вектора. Для этого используются специальные ферменты - рестриктазы, сама реакция называется рестрикцией. В природе рестриктазы используются бактериями для защиты от чужеродной ДНК; генному инженеру набор рестриктаз, хранящийся в морозильнике, столь же необходим, как ножницы портному. Рестриктазы узнают и разрезают строго определенные нуклеотидные последовательности, которые называются сайтами рестрикции. Для каждой рестриктазы есть свой сайт узнавания ДНК, обычно включающий в себя от четырех до восьми расположенных подряд нуклеотидов. Вектора, предназначенные для клонирования, содержат специальный полилинкер - десяток идущих друг за другом разных сайтов рестрикции, перед которым находится промотор - последовательность нуклеотидов, с которой бактерии начинают считывать РНК любого гена.

Лигаза

Добавим к выбранному нами вектору рестриктазу и подходящий для ее работы солевой раствор (он прилагается к купленному ферменту) и поставим пробирку в термостат, разогретый до 37 °С. Через час все кольцевые молекулы вектора в растворе станут линейными - рестриктаза нашла свой сайт на полилинкере и разрезала в этом месте ДНК. Теперь смешаем разрезанный вектор и кДНК и добавим новый фермент - лигазу. Если рестриктаза играет в нашей работе роль ножниц, то лигаза, наоборот, является иголкой, сшивающей две молекулы ДНК. Спустя несколько часов все молекулы вектора снова станут кольцевыми, но теперь внутри полилинкера в каждой из них будет содержатся по одной молекуле кДНК. Правда, некоторые молекулы вектора "зашились" обратно сами на себя - для борьбы с этим явлением существуют специальные способы, но мы сейчас обойдемся без них, просто возьмем в следующую стадию побольше ДНК и будем надеяться на лучшее.

Ампициллин

Мы достигли кульминационной части первого этапа работы - в нашей пробирке находится смесь молекул кДНК коралла, среди которых и ген зеленого флуоресцентного белка. Осталось поместить все эти молекулы в бактерии (такая процедура называется трансформацией) и посмотреть, что получится.

Технически трансформация E. coli производится очень легко. Достаточно смешать бактерии и вектор, добавить немного солей кальция и пропустить через смесь короткий импульс электрического тока. Некоторые бактерии при этом погибают, с другими ничего не происходит, но многие почему-то "всасывают" в себя ДНК вектора. Почему так происходит, никто не знает, тем не менее все генные инженеры пользуются этим странным свойством E. coli.

Возьмем стерильный стеклянный шпатель и вотрем трансформированные бактерии в плоские чашки, содержащие питательную среду и антибиотик ампициллин. Используемый нами вектор содержит ген устойчивости к ампициллину, кодирующий специальный фермент, который успевает разрушить молекулы антибиотика до того, как антибиотик убьет бактерию. Таким образом, на нашей питательной среде выживут только бактерии, "проглотившие" вектор, все нетрансформированные бактерии погибнут. Поставим чашки с бактериями на ночь в теплое место, пусть подрастут.

На следующее утро внимательно рассмотрим содержимое чашек. На агаровом геле видны бляшки диаметром около полумиллиметра - это колонии бактерий. Каждая колония является потомством одной единственной трансформированной бактерии, попавшей вчера в чашку, соответственно все бактерии внутри одной колонии содержат один и тот же вектор. Берем синюю лампочку (а еще лучше - ставим чашку под флуоресцентный микроскоп) и начинаем искать.

Нам придется исследовать около сотни тысяч бактериальных колоний (не волнуйтесь, это всего несколько десятисантиметровых чашек). Почти все колонии оказались неокрашенными, но вот смотрите - одна колония ярко светится зеленым светом! Нам повезло, мы нашли бактерии, трансформированные вектором с геном зеленого флуоресцентного белка. Вполне возможно, что мы обнаружим еще несколько таких колоний, некоторые из них будут светиться не зеленым, а желтым или красным светом - значит, там экспрессируются желтый или красный флуоресцентный белок, это уже не важно. Берем деревянную зубочистку и аккуратно дотрагиваемся кончиком до светящейся колонии. Теперь кидаем зубочистку в колбу с питательной средой - нам надо много бактерий, чтобы выделить из них вектор.

…и снова центрифуга

На следующее утро питательная среда в колбе стала мутной - это размножились попавшие туда бактерии. Все они содержат нужный нам ген, осталось только выделить из них ДНК, чтобы перенести этот ген в мышь. Как выделить ДНК из бактерий, мы уже примерно представляем - методика очень похожа на выделение РНК из коралла, только содержит меньше стадий. Прокрутим среду с бактериями на центрифуге, к осадку добавим немного щелочи и соли SDS (это основной компонент мыла и стиральных порошков), чтобы разрушить клеточные стенки бактерий. Центрифугируем, избавляемся от нерастворенных остатков бактерий, из полученного чистого раствора осаждаем ДНК путем добавления спирта и ацетата натрия и растворяем ее в воде.

Мы получили раствор, содержащий огромное количество копий вектора со вставленным в них геном зеленого флуоресцентного белка из коралла. На это ушло около недели и несколько десятков тысяч долларов, потраченных на приборы и реактивы. В принципе, за пятьсот долларов мы могли бы купить уже готовый вектор, но так было бы неинтересно. Теперь надо вырезать из вектора ген флуоресцентного белка (мы уже знаем, что это делается с помощью рестриктазы) и очистить ДНК нашего гена от ДНК вектора.

Бромид этидия

Отделение двух (или больше) разных фрагментов ДНК друг от друга производится с помощью физического метода, который называется электрофорезом. Технология основана на том, что последний нуклеотид в молекуле ДНК несет на себе отрицательный заряд. Если поместить ДНК в электрическое поле, она будет двигаться от анода (–) к катоду (+). Если поместить ДНК в вязкий раствор, например в агарозный гель (собственно, это обычное желе, только без вкусовых добавок), более длинные молекулы ДНК будут двигаться к катоду медленнее - им труднее протискиваться через агарозу. Поскольку фрагменты ДНК одинаковой длины будут двигаться с одинаковой скоростью, мы в итоге получим гель, на котором ДНК распределена в виде полосок. Полоски, содержащие более длинные фрагменты, будут находиться ближе к аноду, короткие фрагменты протиснутся дальше к катоду. Для того чтобы полоски были видны, в гель добавляется специальное вещество, бромид этидия - он связывается с ДНК и светится под ультрафиолетом. Не забудьте надеть перчатки - бромид этидия является канцерогеном (впрочем, не слишком сильным, когда-то его использовали в качестве глистогонного средства).

После того как мы вырезали ген флуоресцентного белка из вектора и провели электрофорез полученной смеси, мы увидим на геле две полоски ДНК. Наш ген имеет длину всего около шестисот нуклеотидов, он гораздо короче, чем оставшийся вектор. Вырезаем нужную нам полоску геля и выделяем из нее ДНК.

Промоторы

Теперь, когда у нас в руках находится лишенный примесей ген, от работы с мышью нас отделяет всего один шаг - к этому гену надо присоединить промотор, с которого клетки мыши смогут начинать чтение РНК. Мы используем универсальный CMV-промотор, полученный из цитомегаловируса, - такой промотор работает во всех млекопитающих. Для этого мы повторим уже знакомые нам процедуры - клонируем ген в вектор, содержащий перед полилинкером CMV-промотор, а потом вместе с промотором вырежем обратно.

Все готово, идем ловить мышь.
Этап второй - внедрение гена в геном мыши

Процедура создания трансгенной мышки короче в описании, чем клонирование нового гена, однако времени она займет больше. Нам придется подождать по меньшей мере три недели, пока трансген родится - беременность у мышей длится двадцать один день. Кроме того, эта работа опаснее (мышь может укусить) и более кровавая - животным придется делать хирургические операции.

Дадим беременной самке эфирный наркоз и аккуратно извлечем из яйцевода одноклеточные эмбрионы (зиготы). Нам нужна самая ранняя стадия эмбрионального развития, когда сперматозоид уже слился с яйцеклеткой, но их клеточные ядра еще плавают внутри зиготы по отдельности. Помещаем зиготу под микроскоп и инъецируем раствор ДНК в одно из ядер. Нам потребуется микроинъектор - объем впрыскиваемой жидкости не превышает одного пиколитра. Иглу для микроинъекции мы сделаем сами из тонкого стеклянного капилляра. Для этого капилляр закрепляется в специальном устройстве, которое нагревает его посередине и резко дергает за концы. Вытянувшийся кончик иголки так тонок, что им можно проткнуть клеточное ядро, только придется воспользоваться микроманипулятором - наши руки не приспособлены для столь тонких операций.

Теперь нам нужна еще одна самка, которая станет суррогатной матерью. Остается только подсадить инъецированные зиготы к ней в яйцеводы и подождать - через три недели родится первая сделанная нашими руками трансгенная мышка, ярко светящаяся зеленым светом при помещении в детектор валют.

Часть процедур, без которых можно было обойтись, я опустил, но, вообще говоря, большинство молекулярных биологов без них не обходятся. В идеале на вышеописанную работу требуется месяца полтора, однако даже в хорошо оснащенных лабораториях с опытными сотрудниками на все про все уйдет не меньше года. Минимальную стоимость необходимого оборудования и реактивов можно оценить в 15–20 тысяч долларов; впрочем, работать в таких спартанских условиях будет нелегко. Для комфорта хорошо бы потратить раз в десять больше.