Биочипы

[i37034]

В последнее время приходится много слышать о биологических компьютерах, которые, якобы, должны в скором времени вытеснить традиционные вычислительные машины. При этом упоминаются биологические микрочипы, которые «уже сейчас» находят широкое применение и производство которых стремительно растет. И хотя биочипы действительно существуют и действительно имеют потенциально очень широкую область применения, все не совсем так: классическим компьютерам в ближайшее время вряд ли что-то угрожает.

Так что же такое биочип?

Биологические чипы предназначены для быстрого секвенирования, то есть определения нуклеотидной последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в исследуемой пробе. Наверное, всем известно, что генетический код человека хранится в виде двойной спирали ДНК, образованной двумя полимерными цепями (рис. 1). Каждая из этих цепей представляет собой длинную последовательность, образованную из четырех нуклеиновых кислот: аденина, гуанина, тимина и цитозина. При этом последовательность одной цепи однозначно определяет последовательность другой, поскольку нуклеиновые кислоты, расположенные на одинаковых позициях в разных цепях, являются комплементарными. То есть если на сто тридцатой позиции в одной цепи находится аденин, то на той же позиции во второй цепи должен находится тимин, а если на двадцатой позиции во второй цепи стоит цитозин, то с полной уверенностью можно утверждать, что в первой цепи на двадцатом месте стоит гуанин. Когда две цепи объединяются в спираль, между комплементарными нуклеиновыми основаниями образуются водородные связи, которые и удерживают цепи вместе. И именно на способности комплементарных оснований образовывать химические связи основан принцип действия биологических чипов.

Технологически биочип представляет собой матрицу, состоящую из сотен и тысяч ячеек. В каждой из ячеек закреплен олигонуклеотид - последовательность из нескольких нуклеиновых кислот. Длина олигонуклеотидов во всех ячейках одинаковая, отличаются они лишь последовательностью нуклеиновых кислот. Исследуемая ДНК режется на кусочки и проходит предварительную обработку, которая заключается в том, что к каждому из кусочков прикрепляется флуоресцентная метка. Таким образом получается набор из огромного числа маркированных олигонуклеотидов, являющихся составными частями исходной ДНК. Далее исследуемый образец наносится на все ячейки чипа, а затем, спустя некоторое время, смывается. Если в наборе имеется олигонуклеотид, комплементарный закрепленному в ячейке, то между ними, как мы сказали выше, образуется связь, и при промывании он не будет удален, в отличие от олигонуклеотидов, которым не нашлось комплемента (рис. 2). После промывки чип помещается в специальный флуоресцентный микроскоп, где по световому сигналу, «метящему» ячейки с образовавшейся парой цепей, определяется состав проб: носителем этой информации оказываются интенсивность и цвет излучения (рис. 3). В самом деле, «светящиеся» ячейки однозначно кодируют олигонуклеотиды исходной пробы: зная олигонуклеотиды, которые были изначально помещены в данные ячейки, и учитывая однозначность образования пар, можно сделать вывод о составе фрагмента исследуемой ДНК.

Легко видеть, что единственная общая черта биологических и кристаллических чипов - наличие огромного количества идентичных миниатюрных элементов, размещенных рядом друг с другом. Правда, ячейки биочипа по полупроводниковым меркам просто огромны - 100х100х20 мкм. Именно такого размера ячейки биочипов, производящихся у нас (в Институте молекулярной биологии им. Энгельгардта, www.eimb.relarn.ru). В США разработана другая технология, которая позволяет при помощи лазеров прикреплять олигонуклеотиды прямо на стеклянную подложку, без связывающего геля (рис. 4), благодаря чему получаются гораздо более компактные (но и более дорогие) чипы. Кроме того, при использовании подобных чипов для секвенирования требуется намного более чувствительная техника, что также не способствует снижению затрат на анализ ДНК. Точность анализа в обоих случаях примерно одинакова  [1]. Именно невысокая цена российских биочипов делает их конкурентоспособными на мировом рынке.

Принцип действия биочипов весьма прост, и трудности их построения - чисто технологические и экономические: из-за дороговизны биочипы до сих пор не находят применения даже во многих странах благополучной Европы.

Хорошо, пусть биологические чипы непригодны для построения вычислительных систем, но ведь какая-то польза от них есть? Есть. Вариантов их применения великое множество, например, в проекте по расшифровке человеческого генома. Этот грандиозный проект, на выполнение которого тратятся огромные деньги, должен завершиться в 2002 году, хотя существенная часть его уже реализована. Задачей проекта является нахождение нуклеотидной последовательности всех генов человека, общее количество которых превышает 100 тысяч. Некоторые СМИ даже сочли задачу «расшифровки генома» полностью решенной, хотя это не совсем так… Уже сейчас известны гены, мутации в которых являются причиной тяжелейших болезней. Например, наследуемые изменения в некоторых генах приводят к патологии клеток крови, обрекающей новорожденного на скорую смерть. В тех случаях, когда у родителей ребенка имеется предрасположенность к подобного рода заболеваниями, можно взять пробу околоплодной жидкости и, воспользовавшись биочипом, быстро выяснить, унаследовал ребенок болезнь или нет. В зависимости от результатов теста принимается решение: сохранить плод или прервать беременность. Стандартные методы анализа генома слишком длительны, тогда как аборт можно делать лишь на ранних стадиях беременности.

Используя биочипы, можно диагностировать не только врожденные заболевания, но и болезни, являющиеся результатом прижизненных мутаций в генетическом коде. В геноме человека есть два гена, которые в норме расположены достаточно далеко друг от друга. В результате патологических перестроек в ДНК они могут оказаться по соседству. Этот факт служит достоверным свидетельством начала лейкоза (рака крови). Например, таким способом лейкоз выявляется на несколько лет раньше, нежели стандартным путем. И многих людей можно было бы спасти, пройди они вовремя подобную проверку. Существенную помощь могут оказать биочипы и при пересадке органов. Основной проблемой при подобного рода операциях является отторжение имплантированных тканей иммунной системой человека. Маркером, сидящим на каждой человеческой клетке и служащим для отделения своих клеток от чужих, являются белки главного комплекса гистосовместимости. Чтобы избежать отторжения, необходимо, чтобы белки-маркеры на имплантированной ткани как можно меньше отличались от белков-маркеров пациента. Поэтому идеальным донором тканей являются однояйцовые близнецы, у которых белковые маркеры совпадают. Однако далеко не у всех людей имеются однояйцовые близнецы. Один из способов решения проблемы совместимости заключается в клонировании животных с теми же белками главного комплекса гистосовместимости, что и у пациента. (Кого-то этот факт, возможно, расстроит, но оказывается, что животным, наиболее близким человеку по строению тканей, является свинья.) Однако на данный момент, даже если опустить все этические соображения («что может вырасти из свиньи, если в нее встроить человечески гены?»), этот вариант относится скорее к области фантастики. Гораздо реальнее подбирать при помощи биочипов наиболее подходящего донора среди людей, родившихся естественным путем. Донора, пересадка органов от которого вызвала бы минимальный иммунный ответ.

Разрабатываются также биочипы, которые позволили бы диагностировать различные формы туберкулеза. В сороковые-пятидесятые годы благодаря появлению антибиотиков туберкулез перестал считаться неизлечимой болезнью. Однако с тех пор появилось множество разновидностей туберкулезной палочки, устойчивых к воздействию антибиотиков. В настоящее время, когда больной поступает к врачу, у него берут пробу слюны и в течение нескольких месяцев выясняют, являются ли его туберкулезные палочки ус тойчивыми к воздействию наиболее распространенных антибиотиков (таких как, например, рифампицин). Все то время, что идет исследование, больной находится в одной палате с товарищами по несчастью, от которых может заразиться другими формами болезни. Использование же биочипов позволяет осуществлять подобную проверку не за несколько месяцев, а за несколько десятков минут.

Помимо медицины, биочипы можно использовать для контроля за некоторыми смертельно опасными бактериями. Например, споры сибирской язвы практически ничем не отличаются от своих безобидных собратьев, и опознать их при помощи стандартных способов биологического и химического анализа практически невозможно. Единственный надежный способ - заразить какое-нибудь животное и посмотреть, сдохнет оно или нет. Но это слишком долгий и опасный способ. При помощи же биочипов идентификация может быть проведена за десять минут. Разработка таких биочипов осуществлялась по заказу Министерства обороны США, которое всерьез озабочено возможностью использования спор сибирской язвы в качестве биологического оружия террористами. Достаточно разорвать маленький пакетик со спорами в метро, чтобы обречь на смерть сотни и тысячи людей. Наверное, во многом интерес именно к сибирской язве подогрет тем, что некоторое время назад отдельным американским чиновникам стали приходить письма без обратного адреса. Когда те открывали конверт, из него высыпался какой-то порошок. Записка, лежавшая в конверте, гласила, что порошок - и есть споры сибирской язвы. К счастью, никакой язвы там не было, и все чиновники остались живы, но такие своеобразные шутки вылились в большие научные проекты, на которые затрачены огромные деньги.

Приведенные примеры свидетельствуют в пользу того, что в ближайшее время технология биочипов будет стремительно развиваться. О реальности подобных предположений говорит и тот факт, что на рынок биочипов стали выходить такие гиганты высоких технологий, как Motorola. Совместно с компанией Packard Instrument она планирует запустить биочипы в массовое производство, выделив на это в ближайшие три года 19 млн. долларов. Только за последние два месяца корпорация смогла получить пять новых патентов в области «биокомпьютеров». Motorola не одинока в своем интересе: в борьбу за этот перспективный рынок, объемы продаж на котором в ближайшие 3-5 лет оцениваются в 1,3 млрд. долларов, включились десятки компаний.

Вполне возможно, что скоро любой из нас сможет купить все необходимое оборудование, для того чтобы в домашних условиях копаться в собственном геноме, разыскивая следы болезней или генетическую предрасположенность к гениальности.