Под прицелом синхротрона
АрхивСегодня единственным экспериментальным способом с достаточной точностью узнать, что представляет собой трехмерная структура белка, является рентгеноструктурный, или кристаллографический, анализ.
Сегодня единственным экспериментальным способом с достаточной (атомарной) точностью узнать, что представляет собой трехмерная структура белка, является рентгеноструктурный, или кристаллографический, анализ. Именно с его помощью добывается исходный материал для красивых картинок, которыми обильно украшены статьи и обложки научных журналов. И, разумеется, не только для картинок: без преувеличения можно сказать, что экспериментальные белковые структуры представляют собой основу современной вычислительной молекулярной биологии.
Рентгеноструктурный анализ имеет почти столетнюю историю, но применяться на самых сложноорганизованных биологических объектах начал лишь в 1960-х годах - начиная с революционных экспериментов Перутца по расшифровке структуры миоглобина и гемоглобина. На сегодняшний день известны структуры около 15 тыс. белков и их комплексов с биологически важными молекулами.
Основные принципы рентгеноструктурного анализа довольно просты и знакомы каждому со школьных уроков физики. Кристаллический объект представляет собой серию практически идентичных объектов, упакованных в трехмерную решетку. Монохроматическое рентгеновское излучение (с длиной волны от 0,7 до 1,6 Е, соизмеримой с межатомными расстояниями в молекулах), проходя через кристалл, рассеивается на электронных оболочках периодически повторяющихся атомов и образует дифракционную картину (рис. 1). С помощью Фурье-преобразования полученной дифракции электронную плотность исследуемого кристалла можно рассчитать по формуле:
Единственная трудность принципиального характера - это невозможность на данном этапе развития техники получить когерентное монохроматическое рентгеновское излучение высокой интенсивности, что, в свою очередь, приводит к невозможности экспериментального определения фазового сдвига дифракционной картины. Впрочем, узнать эту неизменяемую величину можно обходным путем. Таких путей немало, и все они требуют высокого мастерства исследователя, а порой и везения. Не вдаваясь в подробности методов определения фаз, можно сказать, что обычно на решение такой задачи тратится до полугода. После грубого определения фаз можно рассчитать приблизительную форму электронной структуры исследуемой молекулы. Заключительный этап рентгеноструктурного определения структуры - это интерпретация электронной плотности, или рентгеноструктурное уточнение. На данном этапе структура многократно подвергается программной подгонке и ручной доводке для достижения наилучшего совпадения с электронной плотностью.
С математической точки зрения, идет минимизация некой штрафной функции в пространстве координат молекулы. Огромная размерность системы не позволяет найти искомый минимум автоматически и требует постоянного визуального контроля. Такова сухая теория.
На практике все выглядит гораздо красивее и заманчивее. В данном обзоре, который наверняка является самым кратким в мире, нет места рассказывать о методике наращивания и выделения белков из бактерий и методике его очистки. Получение из раствора белка кристаллов до сих пор не объяснено научно и больше похоже на шаманство. Тем не менее, этим способом все пользуются, хотя и имеют о нем смутное представление. А созерцание кристаллов белка, особенно в поляризованном свете, доставляет массу наслаждения (рис. 2).
С каждым годом совершенствуется техника сбора данных и улучшается техническое оснащение рентгеноструктурного экспериментатора. Все больше синхротронов, как источников мощного рентгеновского излучения, переоборудуются для нужд кристаллографии. Давно вошла в практику криозащита (с помощью жидкого азота) кристаллов во время облучения. Детекторы дифрагированного излучения постоянно улучшаются, растет чувствительность, размер площади одновременного детектирования и скорость записи полученных данных.
К сожалению, за последнее время методика уточнения не претерпела существенных изменений. Большинство современнейших программных комплексов мало отличаются от программ десятилетней давности. Как и десять, и двадцать лет назад, идет ручной фиттинг (подгонка) белковой модели к электронной плотности (рис. 3). Теоретическое же осмысление огромного экспериментального материала вообще находится в плачевном состоянии. Структурная биология в этом отношении является уникальной наукой. Теория организации белковых структур практически не продвинулась от первых работ Рамачандрана, отставая почти на полвека от экспериментальных исследований.
Огромное поле деятельности открывается для молодых исследователей на стыке физики, химии и биологии. Эта область науки испытывает острую потребность как в физиках и химиках, так и в программистах, интересующихся основами жизнедеятельности земных организмов.
К сожалению, экспериментальная база в России сильно уступает оснащению зарубежных институтов. Тем временем в Америке и Европе открываются сотни, а то и тысячи новых мест для кристаллографов. Коммерческие фирмы, разрабатывающие лекарственные препараты, испытывают нехватку высококвалифицированных кадров (какая-то реклама капиталистического труда получается). В России осталось несколько лабораторий рентгеноструктурного анализа, которые тоже нуждаются в молодых исследователях, в Москве это Институт кристаллографии, Институт биоорганической химии, Институт молекулярной биологии; есть базы в Пущино, Новосибирске и, может, где-то еще.
[i39828]
Дабы отдохнуть от сухой теории рентгеноструктурного анализа, расскажу о самом приятном этапе определения структуры нового белка. Те, кто знаком с этой областью, могут предложить множество других этапов, без которых не решить структуру. Это и первые кристаллы, появившиеся после долгой работы химика, и первая карта электронной плотности, позволяющая приступить к определению структуры, и расшифровка структур комплексных соединений, с помощью которых удается проникнуть в тайны механизма работы белка. Но ничто не сможет сравниться по количеству фана (fun) со сбором данных на синхротроне.
С общим видом, а также расположением комнат, коридоров и лестниц на синхротроне большинство читателей должно быть знакомо по Half-Life. Дизайн и, возможно, сценарий этой игры был практически полностью взят из реальной жизни на синхротроне или еще каком-то ином ядерном объекте. Кроме всего прочего, синхротрон подавляет своей внушительностью.
Кроме обычных, земных удовольствий (новая машина напрокат для поездки до ближайшего европейского синхротрона и ужин в пабе входят в командировочные расходы) огромную радость доставляют хорошо дифрагирующие кристаллы, а за сутки работы таких попадается до десятка. Непередаваемо ощущение, когда из ничего получается интенсивная, колоритная картина рассеяния. «Ничего» - это, конечно, условно, но рентгеновское излучение не видно невооруженным глазом, кристалл размером 50 мкм тоже глазом наблюдается плохо, а полученная картинка… Это нужно пережить!
Во время сбора данных с кристалла, которое обычно длится около часа, можно, зачерпнув ведерком жидкого азота, заняться изучением свойств этой чудесной жидкости. Самый красивый фокус - это превращение кусочка бумаги с помощью банки из под кока-колы и азота в порохообразное вещество. Школьных знаний по физике достаточно, чтобы объяснить это явление.
Но всякому празднику наступает конец, и утром, наскоро записав на ленту насколько гигабайт полученных данных и для надежности кинув их по FTP на работу, невыспавшиеся, все едут домой. Но смерть всегда является началом новой жизни, и, вернувшись домой, можно потихоньку собираться в следующую экспедицию за новыми данными.
